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上海钒帜闪式提取之罗汉果提取效果分析
作者:admin 发布时间:2020-03-18 18:46

  采用闪式提取器提取罗汉果中多种活性成分的具体方法。首先将有效成分的制备采用闪式提取器和树脂分离方法;通过分光光度法和高效液相色谱法等对各成分进行检测。最终得到罗汉果中有效成分的收率为甜苷3. 76%(纯度90. 16%多酚3. 36%,游离多糖12. 41%,游离低聚糖11. 72%,结合多糖1. 61%,结合低聚糖1. 47%,氨基酸7. 78%,生物碱8. 32%。最后确立了连续提取分离罗汉果中多种有效成分的工艺。

  罗汉果介绍:罗汉果为葫芦科植物罗汉果的干燥果实,是我国广西特有的药食同源植物。现代药理研究表明罗汉果有镇咳祛痰、泻下通便等作用。上世纪90年代中期,我国已批准罗汉果甜苷为食品添加剂,对肥胖症及糖尿病患者可作为甜味剂代替蔗糖。

  罗汉果中除了上述的甜苷外还含有其他多种活性成分,如多酚类、糖类和氨基酸等。但对罗汉果的研究一般集中在苷类成分,产品也多为甜苷系列,罗汉果中其他有效成分没有得到充分的利用。目前罗汉果甜苷已远销东南亚、日本、加拿大和美国等地,展现了广阔的市场前景。为了提高我国珍贵的罗汉果资源的利用率,本实验对罗汉果中多种活性成分的综合提取进行了研究。

  制备方法

  1、提取方法:采用闪式提取法。称取25g去核后的干罗汉果,置闪提容器中,加入375 ml蒸馏水,即料液比为1:15(g:ml),于40度下浸泡2h后,进行闪式高速破碎提取,以3500r/min转速提取2次,每次1min。

  2. 分离纯化方法:首先对罗汉果原料进行闪式高速破碎,离心后的上清液通过柱1洗脱后得到多酚,柱1的收集液再通过柱2,其收集液经过乙醇分级沉淀分别得到游离多糖和游离低聚糖,柱2的洗脱液再通过柱3,其收集液即为甜苷;离心后的沉淀经过酸解处理后离心,此上清液通过柱4洗脱后得到生物碱,此沉淀再经酶解处理和乙醇分级沉淀,分别得到氨基酸、结合多糖和结合低聚糖。工艺流程见图1

  目前,对于连续制备罗汉果中多种有效成分的工艺鲜有报道,一般研究往往只注重单一成分的提取分离,本工艺首次成功实现了连续提取分离罗汉果的8种有效成分。实验证明该工艺具有较好的连续性和有效性,为罗汉果的综合利用开辟了新的道路。

  图1 工艺流程图

  柱1.聚酞胺树脂 柱2.XAD大孔吸附树脂 柱3.D型大孔吸附树脂 柱4.D型离子交换树脂

  检测方法与结果

  甜苷 采用高效液相色谱法。

  色谱条件:waters Sunfire C18色谱柱(150mmX 4. 6 mm; 5um) 流动相A为水,B为乙腈;梯度洗脱条件为0~40min,5%一68%乙腈;流速为1mL/min,检测波长为203mm,进样量为15ul;柱温为室温。

  对照品溶液的制备:精密称取罗汉果甜苷V对照品10mg置于10ml的容量瓶中,加甲醇溶解至刻度,混匀,制成浓度为1mg/ml的母液。

  供试品溶液的制备:精密称取本实验制得的甜苷样品、市售罗汉果甜苷样品各50mg多分别置于10ml的容量瓶中,加甲醇溶解至刻度,混匀,微滤后分别得到罗汉果甜苷样品溶液和市售罗汉果甜苷样品溶液。

  标准曲线的绘制:将母液配成浓度分别为0. 5, 0. 6, 0. 7, 0. 8, 0. 9 mg/ml 的溶液,微滤后分别进样。以峰面积Y刊浓度X( mg/mI)进行线性回归,得到罗汉果甜苷V的回归方程为Y=4697485 X+45414r =0.9989罗汉果甜苷V在0. 5 ~ 0. 9mg/ml范围内线性关系良好。

  样品的测定:取本实验制得的罗汉果甜苷样品溶液和市售罗汉果甜苷样品溶液各15ul,按"2.1.1”的色谱条件进行测定,结果罗汉果甜苷V保留时间为18 min,与市售罗汉果样品相比,本实验制得的甜苷样品色谱图基线稳定,各峰分离效果较好,并说明甜苷V纯度较高。

  多酚采用福林酚比色法。

  标准曲线的绘制:标准曲线采用没食子酸作为对照品,应用福林酚显色方法,用分光光度计测定在760nm下的吸光度,由吸光度Y对浓度X(ug/ml)进行回归计算,得到标准曲线方程:Y=0.0915X+0.0461,r=0.9961.

  样品的测定:精密称取本实验制得的多酚样品8. 4 mg多按“3. 2. 1”项下方法进行测定。

  多糖(总糖)采用蒽酮比色法。

  标准曲线的绘制:标准曲线采用葡萄糖作为对照品,应用蒽酮显色方法,用分光光度计测定在620nm下的吸光度,由吸光度Y对浓度X(ug/ml)进行回归计算,得到标准曲线方程:Y=0.0422X-0.0015,r=0.9999

  样品的测定:精密称取本实验制得的游离多糖和结合多糖样品各50 mg按“2. 3. 1”项下方法进行测定。

  低聚糖(还原糖)采用斐林试剂比色法。

  标准曲线的绘制:标准曲线采用葡萄糖作为对照品,应用斐林试剂显色方法,用分光光度计测定在620nm下的吸光度,由吸光度Y对浓度X(ug/ml)进行回归计算,得到标准曲线方程:Y=0. 6448X+0.0048 r=0. 9998

  样品的测定:精密称取本实验制得的游离低聚糖和结合低聚糖样品各50mg按上述绘制标准曲线的方法进行测定。

  氨基酸 采用茚三酮试剂颜色反应。取氨基酸样品溶液1mL加入茚三酮试剂2 ~3滴,加热煮沸4 ~ 5 m in冷却后观察,溶液呈紫色,此法常用来检测氨基酸类物质。

  生物碱采用碘 碘化钾试剂颜色反应。取生物碱样品溶液1ML加入碘 碘化钾试剂2 ~3滴,溶液呈棕褐色并浑浊,表明溶液中含有生物碱类成分。

  测定结果 罗汉果多种有效成分的测定结果如表1所示。本工艺在保证获得高收率、高纯度甜苷的基础上,进一步分离出罗汉果中7种有效成分。其中甜苷收率较高,即甜苷重量占原料重量的3. 76%,甜苷回收率高达98. 69%(罗汉果中甜苷理论量为3. 81% )说明本工艺对甜苷进行了较有效的提取;另外,与目前市场销售的罗汉果甜苷样品(纯度70%左右)相比,本工艺制得的甜苷纯度较好,可达到90%

  表1罗汉果中各成分定量测定结果

  成分 含量% 收率% 纯度%

  甜苷 3 39 3. 76 90.16

  多酚 97 3.36 58.63

  游离多糖 4.98 12.41 40.13

  游离低聚糖 2.22 11.72 18.97

  结合多糖 0.59 1.61 36.88

  结合低聚糖 0.34 1.47 24.29

  氨基酸 —— 7.78 ——

  生物碱 —— 8.32 ——

  3讨论

  本实验在罗汉果的提取方面,采用了较新的闪式提取技术,该技术依靠高速机械剪切力和超速动态分子渗滤作用,在室温及溶剂存在下,将药材破碎至细微颗粒,并使有效成分迅速达到组织内外平衡。实验结果表明该技术在罗汉果提取方面具有效率高、时间短、能耗低的特点,较适合其工业化的生产。

  除了上述工艺分离得到罗汉果的八种有效成分外,笔者还尝试从最后的滤渣中分离出半纤维素(收率2. 1%)和碱木质素(收率3. 0%)成分,关于它们的应用还需进一步的研究。总之,通过本工艺使得罗汉果的利用率由4%左右(甜苷利用率)提高到50%以上,这对罗汉果的综合开发利用具有重要的意义。

  本实验建立了梯度洗脱测定甜苷的HPLC法,此法对罗汉果甜苷的检测具有良好的精密度和重现性,这对其他皂普类成分的HPLC检测也具有参考价值。

  通过闪式提取法实验第一次发现了罗汉果生物碱。生物碱是一类具有抗菌消炎、抗肿瘤等功能的活性物质,它具有广阔的市场应用前景。

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